Влияние нового полифункционального кровезаменителя на активность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты сердца при острой смертельной кровопотере

Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови, г. Ташкент, Узбекистан

Одним из важных направлений современной медицины является совершенствование средств лечения экстремальных состояний, уровень смертности от которых до сих пор остается весьма высоким, что зачастую связано с недостаточной эффективностью применяемых современных кровезаменителей [2, 3]. Путем повышения эффективности инфузионной терапии при критических состояниях, в частности, при острой смертельной кровопотере (ОСК), могло бы стать применение нового препарата, созданного в Научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови МЗ РУз, обладающего антиоксидантной, диуретической, детоксицирующей активностью и гемореологическим действием, обеспечивающего энергетические потребности организма, способного ингибировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и восстанавливать антиоксидантную систему (АОС) организма, восстанавливать функцию почек и метаболические процессы на клеточном и тканевом уровне [7, 11, 12, 13].

Целью исследования явилось изучение эффективности действия нового полифункционального кровезаменителя при ОСК на активность процессов липопероксидации и состояния антиоксидантной системы сердца.

Материалы и методы исследования. На 60 крысах массой 180-200 г под этаминаловым наркозом была вызвана клиническая смерть острой кровопотерей из сонной артерии в течение 3-5 минут, путем снижения артериального давления до 0 мм рт. ст. Оживление проводили сразу же введением в хвостовую вену крысам следующих кровезаменителей в зависимости от группы: физиологического раствора (0,9% натрия хлорида) (III группы), реосорбилакта (IV группы) и нового полифункционального кровезаменителя (V группы) из расчёта 40 мл/кг массы тела [8, 9].

Животные были разделены на следующие группы: I группа - до кровопотери (интактные), II группа - клиническая смерть, III группа (контрольная) - ОСК после инфузии физиологического раствора, IV группа (сравнения) - после ОСК с инфузией реосорбилакта, а V группа (основная, опытная) - после ОСК с инфузией нового полифункционального кровезаменителя.

В исходном состоянии и через 1 час после инфузии кровезаменителей, были определены гемодинамические показатели: артериального давления (АД), объёма циркулирующей крови (ОЦК) - по разведению синего Эванса [4] и скорость клубочковой фильтрации (СКФ).

Кислотно-основное состояние крови (КОС) (уровень pH крови) изучали на приборе OP-215 (Radelkis, Венгрия).

СКФ рассчитывали по формуле:

СКФ= МСЭ • V/ ПСЭ,

где V - объем экскретированной мочи, МСЭ - концентрация красителя синего Эванса (СЭ) в моче, ПСЭ - концентрация СЭ в плазме крови [6].

Для определения интенсивности процессов ПОЛ и активности АОС в морозильной камере сердце гомогенизировали и в гомогенате определяли содержание малонового диальдегида (МДА), диеновых кетонов, глутатионредуктазы (ГР), глутатионпероксидазы (ГПО), активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы [5, 8] во время клинической смерти и через 15 мин, 1 ч, 12 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч, 72 ч после оживления и введения в III группе физиологического раствора, после инфузии в IV группе реосорбилакта и в V группе - инфузии нового полифункционального кровезаменителя.

Для получения гомогената навеску сердца крысы гомогенизировали с помощью гомогенизатора T10 в 4-х кратном объеме охлаждённой среды выделения (0,1 М трис-НСl-буфер (рН 7,8), содержащий 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1% b-меркаптоэтанол) и центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин [8].

Активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы определяли спектрофотометрически при 340 нм. За ферментативную единицу (Е) принимали количество фермента, необходимого для превращения 1 мкмоля субстрата в 1 мин при 25°С. Активность ферментов выражали в единицах (Ед) на килограмм сырой массы сердца, и в виде удельной активности. Активность ГР определяли в среде, содержащей 50 мМ калий-фосфатного буфера (pH 7,4), 1 мМ ЭДТА, 0,16 мМ восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) и 0,8 мМ окисленного глутатиона (GSSG). Измерение активности ГПО проводили в 50 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 1 мМ ЭДТА, 0,12 мМ NADPH, 0,85 мМ глутатиона (GSH), 0,37 мМ Н2О2, 1 Ед/мл ГР [8].

Активность СОД оценивали по способности гомогенатов ткани миокарда ингибировать спонтанное окисление адреналина в щелочной среде (рН=10,2) и выражали в ммоль/мин/мг белка [1]. В качестве стандарта использовали очищенный препарат СОД ("ICN Biomedicals", США).

Каталазную активность исследуемых образцов определяли спектрофотометрически и выражали в ммоль/мин/г белка [5, 10].

Измерения проводили на спектрофотометре «UNICO 2800» (United products and instruments, Inc., США).

Полученные цифровые данные подвергались статистической обработке с использованием критерия Стьюдента, с применением специального пакета программ на персональном компьютере при помощи программы «Microsoft Office Excel 2007» и «Биостатистика 4.03». Критерием статистической достоверности служило p<0,05.

Результаты и обсуждение. Показано, что у крыс при снижении АД до 0 мм рт. ст. в течение 3-5 мин значение ОЦК определить было невозможно. Животные находились в состоянии клинической смерти. У большинства животных останавливалось дыхание и сердечная деятельность.

Продолжительность умирания составила 4,5±0,7 мин. Биохимические показатели и электролитный состав крови за такой короткий период не менялись, кроме понижения уровня общего белка в 1,3 раза (на 27,3%) (табл. 1).

ОСК способствовала значительному накоплению в сердце МДА и диеновых кетонов уже к концу клинической смерти (табл. 2), когда полностью прекращается кровообращение и оксигенация. Возникающая при этом тяжелая гипоксия организма ингибирует дыхательную цепь митохондрий сердца, что закономерно приводит к восстановлению НАД и НАДН, высвобождению ферритина и Fe2+ из мембран и попаданию их в цитозоль, а также неполному восстановлению растворенного в липидном матриксе мембран кардиомиоцитов молекулярного кислорода, что сопряжено с образованием активных форм кислорода: супероксидных анион-радикалов, перекиси водорода и гидроксильных радикалов [5].

Известно, что в условиях гипоксии дыхательная цепь кардиомиоцитов, в частности, цитохромоксидаза, начинает генерировать активные формы кислорода, в том числе гидроксильные радикалы, которые оказывают разрушающее действие на саркоплазматический ретикулум путем быстрой активации процессов липопероксидации и разрушения SH-групп белков. Кроме того, повышенное образование радикалов кислорода обусловливает острое нарушение функций эндотелия, сопровождается ультраструктурными изменениями клеток сосудистого эндотелия, оказывает протромботическое действие [3].

Таблица 1. Изменения некоторых показателей при кровопотере (АД до 0 мм рт. ст.) и после инфузии кровезаменителей у крыс (M±m)

Таблица 1. Изменения некоторых показателей при кровопотере (АД до 0 мм рт. ст.) и после инфузии кровезаменителей у крыс (M±m)

Примечания: * - достоверность различия (р<0,05) при сравнении результатов с исходными данными (I группа); ^ - то же (р<0,05) при сравнении результатов с данными, полученными при клинической смерти; # - то же (р<0,05) при сравнении результатов с данными, полученными во III группе; & - то же (р<0,05) при сравнении результатов с данными, полученными в IV группе.

Как указано в табл. 2, уровень МДА при клинической смерти (во II группе) увеличивался почти в 2,0 раза, как и диеновые кетоны, в то же время показатели антиоксидантной активности снижались.

При клинической смерти во II группе, относительно значений интактных животных, активность ферментов ГР в сердце была ниже в 1,2 раза, ГПО - в 1,5 раза, СОД - в 2,0 раза, каталазы - в 4,4 раза.

Таблица 2. Влияние ОСК на интенсивность процессов ПОЛ в сердце в восстановительном периоде после оживления (М±m)

Таблица 2. Влияние ОСК на интенсивность процессов ПОЛ в сердце в восстановительном периоде после оживления (М±m)

Примечания: здесь и далее * - p<0,05 по сравнению с показателями I группы; $ - p<0,05 по сравнению с показателями клинической смерти во II группе; ^ - p<0,05 по сравнению с показателями III группы; # - p<0,05 по сравнению с показателями IV группы; # - p<0,05 по сравнению с показателями IV группы; # - p<0,05 по сравнению с показателями IV группы; & - p<0,05 по сравнению с показателями соответствующей группы на 15 мин; @ - p<0,05 по сравнению с показателями соответствующей группы на 1 ч; ® - p<0,05 по сравнению с показателями соответствующей группы на 12 ч; © - p<0,05 по сравнению с показателями соответствующей группы на 24 ч; § - p<0,05 по сравнению с показателями соответствующей группы на 36 ч; δ - p<0,05 по сравнению с показателями соответствующей группы на 48 ч.

Через 15 мин после реанимации во II группе отмечается активизация процессов ПОЛ: повышение содержания МДА и диеновых кетонов в 2,9 и 2,4 раза соответственно. Глубокая гипоксия, вызванная острым обескровливанием организма, повышает количество кислорода, растворенного в липидном матриксе митохондрий миокарда и, тем самым, увеличивает вероятность реакции молекулярного кислорода с восстановленными переносчиками дыхательной цепи, что приводит к усилению образованию свободных радикалов с дальнейшим вовлечением фосфолипидов мембран в цепные свободнорадикальные реакции на фоне пониженной активности антиоксидантных ферментов и уменьшенных запасов биоантиоксидантов [5].

Активность ферментов антиоксидантной системы снижалась: ГР - в 1,3 раза, ГПО - в 1,4 раза, активность СОД - в 3,0, каталазы - в 2,4 раза (таблица 3, таблица 4). В то же время по сравнению с соответствующими показателями при клинической смерти на 15 минуте наблюдения после ОСК и введения физиологического раствора активность СОД снизилась в 1,5 раза, каталазы повысилась в 1,9 раза, также отмечалась тенденция к незначительному снижению ГР и несущественному повышению ГПО.

В III группе, где животных после клинической смерти оживляли при помощи физиологического раствора, через 1 час АД увеличилось до 45,6±0,4 мм рт. ст., а ОЦК повысилось до 44,8±0,4 мл/кг, что относительно значений данных показателей у интактных животных в I группе составляло 40,2% и 76,6% соответственно.

После инфузии физиологического раствора СКФ составила 0,61±0,02 мл/мин, а диурез 0,21±0,02 мл/мин, что по сравнению со значениями данных показателей у интактных животных составило 46,9% и 65,6% соответственно. Продолжительность жизни животных после применения физиологического раствора составила 12,3±1,2 ч, выжило 30% животных.

Через 1 час исследования, после инфузии физиологического раствора, относительно показателей интактных животных уровень МДА был выше в 2,7 раза, диеновых кетонов - в 2,6 раза, а по сравнению со значениями показателей II группы, МДА был выше в 1,4 раза, диеновых кетонов - в 1,3 раза. После введения физиологического раствора через 1 час активность ГР была ниже в 1,6 раза, ГПО - в 2,1 раза, СОД - в 2,8 раза, каталазы - в 2,3 раза, а относительно значений данного показателя во II группе ГР была ниже более чем в 1,3 раза, ГПО и СОД - в 1,4 раза, а каталазы была выше в 1,9 раза.

Через 12 часов в III группе наблюдалось усиление активности процессов ПОЛ: по сравнению со значениями интактных животных в I группе уровень МДА и диеновых кетонов были выше в 2,9 раза, а по сравнению со значениями показателей II группы, уровни данных показателей были выше в 1,5 раза соответственно. Активность антиоксидантных ферментов снижалась после введения физиологического раствора: ГР - в 1,8 раза, ГПО - в 2,1 раза, активность СОД - в 2,0 раза, каталазы - в 2,0 раза соответственно. Через 12 часов, относительно значений II группы после инфузии физиологического раствора ГР была ниже в 1,5 раза, ГПО - в 1,4 раза, каталаза выше в 2,5 раза, а значительных изменений в активности СОД обнаружено не было.

Таблица 3. Влияние ОСК на интенсивность процессов АОС в сердце в восстановительном периоде после оживления (М±m)

Таблица 3. Влияние ОСК на интенсивность процессов АОС в сердце в восстановительном периоде после оживления (М±m)

После 24 часов в III группе, наблюдалась тенденция к незначительному восстановлению изучаемых показателей, хотя по сравнению со значениями показателей I группы: уровень МДА был выше в 2,3 раза, диеновых кетонов в 2,4 раза, а по сравнению со II группой уровень МДА был выше более чем в 1,1 раза, а уровень диеновых кетонов - в 1,2 раза. Показатели АОС в III группе снижались. Так ГР была ниже в 1,8 раза, ГПО - в 1,9 раза, активность СОД и каталазы - в 1,7 раза, а по сравнению с результатами показателей, полученных при клинической смерти, ГР была ниже почти в 1,5 раза, ГПО - в 1,3 раза, активность каталазы, напротив, была выше в 2,6 раза и отмечалась тенденция к повышению активности СОД.

Таблица 4. Влияние ОСК на интенсивность процессов АОС в сердце в восстановительном периоде после оживления (М±m)

Таблица 4. Влияние ОСК на интенсивность процессов АОС в сердце в восстановительном периоде после оживления (М±m)

Через 36 часов после инфузии физиологического раствора, интенсификация процессов ПОЛ снижалась, становилась умеренной, хотя, по сравнению с интактной группой, оставалась на высоком уровне: содержание МДА было выше в 2,0 раза, диеновых кетонов - в 2,0 раза. Через 36 часов после инфузии физиологического раствора также отмечалось улучшение состояния АОС, По сравнению с результатами через 24 часа, ГР оставалась сниженной, ГПО - увеличивалась в 1,2 раза, СОД - почти в 1,2, раза, каталазы - более чем в 1,1 раза соответственно, а по сравнению со значениями во II группе, ГР была ниже в 1,4 раза, СОД была выше в 1,3 раза, каталазы - в 2,9 раза и отмечалась незначительная тенденция к снижению ГПО.

Через 48 часов после смертельной кровопотери и инфузии физиологического раствора, наблюдалась дальнейшая инактивация процессов ПОЛ и повышение активности АОС, по сравнению с 36 часами: МДА снизилась в 1,2 раза, диеновых кетонов - незначительно, ГР не изменилась, ГПО - в 1,2 раза, а СОД и каталазы - в 1,2 раза соответственно, а относительно значений показателей во II группе после применения физиологического раствора МДА была ниже почти в 1,2, диеновых кетонов была незначительно ниже. На 2-е сутки исследования после инфузии физиологического раствора, по сравнению со значением показателей в I группе, ГР была ниже в 1,7, ГПО - в 1,3, СОД - в 1,2, каталазы - в 1,3 раза.

На 3-и сутки по сравнению со II группой содержание МДА снижалось в 1,4 раза, диеновых кетонов - в 1,3 раза, а активность ферментов АОС увеличивалась: ГР - в 1,3, а и ГПО в 1,2 раза, СОД - в 1,8, а каталазы - в 4,0 раза. По сравнению с I группой уровень МДА оставался выше в 1,4 раза, диеновых кетонов в 1,5 раза. Показатели АОС - ГР и ГПО были ниже значений интактной группы: ГР была ниже в 1,6 раза, ГПО - в 1,2 раза соответственно, существенных различий в содержании СОД и каталазы не наблюдалось.

В III группе постреанимационного периода интенсивность процессов липопероксидации в сердце отмечалась усилением, достигая через 15 мин и через 12 часов максимальных значений. Активность антиоксидантных ферментов в сердце также изменялась: ГР, ГПО достигала самых низких значений через 12 и 24 часа, СОД и каталазы через 15 мин после клинической смерти. Выживаемость животных составила 20%.

При сравнительном анализе применения нового кровезаменителя с реосорбилактом были выявлены следующие изменения. Так в V группе наблюдалось более полное и выраженное восстановление показателей гемодинамики, через 1 час после клинической смерти, по сравнению с инфузией реосорбилакта: АД было выше на 38,4%, ОЦК был выше на 9,5%. Тем не менее, уровни АД и ОЦК, относительно показателей интактных животных, были ниже на 38,4% и 13,5% соответственно.

Также через 1 час после инфузии нового полифункционального кровезаменителя в V группе отмечалось восстановление до исходных величин объема диуреза, который, по сравнению со значением данного показателя в III и IV группах был выше на 42,9 и 30,4% соответственно, а СКФ - на 73,8% и 30,9% соответственно.

В V группе pH крови повышался и составил 7,29±0,02, что на 0,08 ед. был выше, чем в IV группе.

При изучении интенсивности ПОЛ и антиоксидантной защиты сердца через 15 минут исследования, после инфузии реосорбилакта и нового кровезаменителя наблюдалось усиление ПОЛ в обеих группах, однако содержание МДА было на 15,6% ниже при инфузии нового раствора, отмечалась тенденция к понижению уровня диеновых кетонов, при этом наблюдалось снижение активности каталазы, хотя она была выше на 86,9%, чем после инфузии реосорбилакта.

Через 1 час после применения нового кровезаменителя, показатели ПОЛ снижались: уровень МДА был ниже на 21,3%, диеновых кетонов - на 24,9%, а активность ферментов антиоксидантной защиты возрастала: ГР была выше на 20,6%, ГПО - на 31,6%, СОД - на 40,8%, каталазы - на 21,8% соответственно, по сравнению с инфузией реосорбилакта.

После 12 часов, после введения нового кровезаменителя, были получены следующие изменения: содержание МДА продолжало снижаться, и было ниже на 41,9%, диеновых кетонов - на 28,5%, активность ферментов продолжала повышаться: ГР было выше на 27,5%, ГПО - на 44,2%, активность СОД - на 19,0%, каталазы - на 31,3%, по сравнению с результатами после инфузии реосорбилакта. Данные изменения свидетельствуют о более выраженном антиоксидантном действии нового кровезаменителя.

В V группе, через 24 часа после введения нового полифункционального кровезаменителя, содержание МДА было ниже на 67,2%, диеновых кетонов - на 61,7%, а активность ферментов ГР была выше на 29,4%, ГПО - на 64,4%, СОД - на 34,3%, каталазы - на 29,2%, по сравнению с реосорбилактом.

Через 36 часов после применения нового кровезаменителя, по сравнению с инфузией реосорбилакта уровень МДА был ниже на 41,9%, диеновых кетонов - на 54,1%, активность фермента ГР была выше на 26,5%, ГПО - на 40,2%, активность СОД выше на 32,3%, каталазы на 21,1%.

После введения нового кровезаменителя через 48 часов, показатели ПОЛ и активность ферментов АОС возвращалась к нормальным величинам, чего не наблюдалось при применении реосорбилакта.

После инфузии нового кровезаменителя через 72 часа активность ферментов АОС, таких как ГР, СОД, каталазы была незначительно выше, чем у I группы интактных животных, чего не наблюдалось при применении реосорбилакта.

Таким образом, новый кровезаменитель обладает выраженными антиоксидантными свойствами. Характерно, что уровень интенсивности ПОЛ начинает снижаться уже на 1 час после применения нового кровезаменителя, а на 2-е сутки достигал нормальных величин, чего не наблюдалось при применении реосорбилакта, после применения, которого, даже через 3 суток, показатели ПОЛ не достигали исходного уровня. Уровень антиоксидантов в сердечной мышце имел минимальные значения на 15 минуте после начала оживления животных и полностью восстанавливался на 2 сутки, чего не наблюдалось при применении реосорбилакта. Новый кровезаменитель был более эффективен при оживлении животных при ОСК.

После инфузии реосорбилакта в IV группе выживаемость составила 40%, а после инфузии нового полифункционального кровезаменителя в IV группе -70%, что на 30% выше.

Продолжительность жизни после применения нового полифункционального кровезаменителя была выше по сравнению с результатом от инфузии реосорбилакта на 3,3±0,1 ч.

Таким образом, результаты исследования показали, что новый полифункциональный кровезаменитель эффективно восстанавливает показатели гемодинамики, почечный кровоток, не оказывает негативного воздействия на биохимические показатели сыворотки крови, увеличивает выживаемость и продолжительность жизни животных в эксперименте, при моделировании ОСК. В целом сравнительное исследование с применением реосорбилакта показало, что использование нового полифункционального кровезаменителя при ОСК эффективно замедляет процессы перекисного окисления липидов и восстанавливает активность ферментов антиоксидантной системы.

Выводы

  1. Введение нового полифункционального кровезаменителя при ОСК приводит к более эффективному замедлению активности процессов ПОЛ и восстановлению АОС в сердце, по сравнению с применением реосорбилакта.
  2. Применение нового полифункционального кровезаменителя при ОСК у крыс, по сравнению с инфузией «Реосорбилакта», приводит к более выраженному восстановлению показателей гемодинамики, биохимических показателей крови и КОС.
  3. Инфузия нового полифункционального кровезаменителя при ОСК приводит к более значительному восстановлению функции почек по сравнению с инфузией реосорбилакта.
  4. Применение нового полифункционального кровезаменителя при ОСК приводит к более значительному увеличению выживаемости животных при сравнительном исследовании с реосорбилактом.